1-10- 1- بیوشیمی پراکسی نیتریت به عنوان مولکول اکسایشگر طبیعی29
1-10-2- پراکسی نیتریته شدن پروتئین ها و آثار آن بر بدن34
1-10-3- پراکسی نیتریت و بیماری های چشمی40
1-11- پراکسی نیتریت و کلسیم42
1-12-مس، اسید آسکوربیک و آب مروارید44
فصل دوم: مروری بر پژوهش های پیشین
مروری بر پژوهش های پیشین………………………………………………………………..45
اهداف پژوهشی…………………………………………………………………………………51
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1-مواد مصرفی……………………………………………………………………………53
3-1-1- دستگاه ها……….…………………………………………………………………53
3-2- تهیه ی محلول ها …………….…………………………………………………….53
3-2-1-محلول برادفورد …….…………………………………….……………………….53
3-2-2-تهیه ی محلول های مورد نیاز روش الکتروفورز ژلی عمودی………………….55
3-2-2-1-تهیه ی محلول آکریل آمید و بیس آکریل آمید…………………………….55
3-2-2-2-تهیه ی محلول20 درصد SDS ……………………………………….…….55
3-2-2-3-تهیه ی محلول 10 درصد آمونیوم پرسولفات………………………………..55
3-2-2-5-تهیه ی بافر تریس 5/0 مولار………………………………………………….56
3-2-2-4-تهیه ی محلول بافر تریس 5/1 مولار…………………………………………56
3-2-2-6-تهیه ی بافر تانک……………………………………………………………….56
3-2-2-7-تهیه ی بافر نمونه X2………………………………………………………….57
3-2-2-8-تهیه ی محلول رنگ‌آمیزی کوماسی بلو………………………………………57
3-2-2-9-تهیه ی محلول رنگ بر کوماسی بلو…….…………………………………….58
3-2-3-تهیه ی محلول های مورد نیاز سنجش گروه کربونیل………………………….58
3-2-3-1-تهیه ی محلول 4،2- دی نیترو فنیل هیدرازین…………………………….58
3-2-3-2-تهیه ی محلول اسید تری کلرو استیک (TCA) 20 درصد…………………59
3-2-3-3-تهیه ی محلول اتانول-اسید اتیل استیک (نسبت 1:1 ، حجمی)………….59
3-2-3-4-تهیه ی محلول گوانیدین هیدروکلراید 6 مولار………………………………59
3-2-4-تهیه ی محلول استوک ANS ………………………………………………………………………….60
3-2-5-تهیه ی محلول استوک تیوفلاوین-…………………………………………….T60
3-2-6-تهیه ی محلول استوک اسید آسکوربیک………………………………………..61
3-2-7-تهیه ی محلول های پروتئینی و تعیین غلظت آن ها……..…………………….62
3-2-7-1-تهیه ی محلول انسولین…….………………………………………………….63
3-3- تهیه ی محیط های کشت باکتری………………………………………………. 64
3-3-1- تهیه ی محیط کشت جامد………………………………………………………64
3-3-2- تهیه ی محیط کشت مایع……………………………………………………….65
3-4- روش ها……………………………………………………………………………….65
3-4-1- آماده سازی پروتئین های لنز چشم گاو………………………………………..65
3-4-2- بیان زیر واحد هایαA و αB-کریستالین انسانی در سلول های BL21 ……. 66
3-4-3- تخلیص زیر واحدهایαA و αB-کریستالین انسانی……………………………67
3-4-4- تعیین میزان خلوص پروتئین به روش SDS-PAGE …………….…..……… 69
3-4-5-فرآیند سنتز پراکسی نیتریت………………………………………………………69
3-4-6- فرآیند پراکسی نیتریته شدن پروتئین های محلول لنز چشم وαA و αB-کریستالین انسانی….………………………………………………………………………..72
3-4-7-مطالعه ی هضم آنزیمی پروتئین های محلول لنز چشم طبیعی و تغییریافته با آنزیم آلفا-کیموتریپسین….…………………………………………………………………72
3-4-8-سنجش مقدار گروه های کربونیل پروتئین های محلول لنز چشم وαA و αB-کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته……………………………………………………73
3-4-9- مطالعه فرآیند توده ای شدن پروتئین های کریستالین طبیعی و تغییر یافته در حضور یون کلسیم……………………………………………………………………………74
3-4-10- مطالعه ی فلورسانس پروتئین های محلول لنز چشم و αA-کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته…………………………………………………………………………74
3-4-10-1- مطالعه ی فلورسانس ذاتی………………………………………………….75
3-4-10-2- مطالعه ی فلورسانس عارضی ANS))……………………………………..76
3-4-10-3- مطالعه ی فلورسانس تیوفلاوین-………………………………………..T77
3-4-11- الکتروفورز ژلی پروتئین های محلول لنز چشم طبیعی و تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت در حضور یون کلسیم…………………………………………………77
3-4-12- مطالعه ی اثر محافظتیαA -کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته بر اکسایش اسید آسکوربیک در حضور یون مس……………………………………………79
3-4-13- مطالعه ی فعالیت چاپرونی αA-کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته در حضور یون مس…………….………….………………………………………………………80
فصل چهارم: نتایج و بحث
بخش اول……………………………………………………………………………………………………………………82
4-1- مطالعه ی اثر پراکسی نیتریته شدن بر ساختار، ایجاد حالت الیگومری و توده ای شدن پروتئین های لنز چشم در حضور یون کلسیم…………………………………………………82
4-1-1-نقش پراکسی نیتریت و کلسیم در بیماری زایی عارضه ی آب مروارید……..83
4-1-2-مطالعه ی فرآیند پراکسی نیتریته شدن پروتئین های محلول لنز……………..85
4-1-2-1-سنجش تغییر حرکت ژل الکتروفورز پروتئین های لنز تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت……………………………………………………………………………………………………..85
4-1-2-2-سنجش مقدار کربونیل پروتئین های لنز تغییریافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………………………………………………………..87
4-1-2-3- مطالعه ی فلورسانس ANS پروتئین های لنز تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت…………………………………………………………………………………………………………..89
4-1-2-4-مطالعه ی فلورسانس دی تیروزین پروتئین های لنز تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت…………………………………………………………………………………………………………..89
4-1-2-5-مطالعه ی اسپکتروسکوپی مرئی-فرابنفش پروتئین های کریستالین تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت…………………………………………………………………………….90
4-1-3-مطالعه ی ناپایداری پروتئولیزی پروتئین های لنز تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت…………………………………………………………………………………………………………..90
4-1-4-مطالعه ی توده ای شدن پروتئین های طبیعی و تغییر یافته ی لنز به وسیله ی پراکسی نیتریت در حضور یون کلسیم………………………………………………………………….92
4-1-5-ارزیابی الیگومری شدن پروتئین های لنز طبیعی و تغییریافته در حضور یون کلسیم به وسیله ی الکتروفورز ژلی……………………………………………………………………………94
4-1-6-مطالعه ی فلورسانس عارضی پروتئین های طبیعی و تغییر یافته لنز در حضور یون کلسیم………………………………………………………………………………………………………………….99
4-1-7-مطالعه ی تشکیل فیبر آمیلوئیدی کریستالین های طبیعی و تغییر یافته در حضور یون کلسیم……………………………………………………………………………………………………101
بخش دوم…………………………………………………………………………………………………………………104
4-2- مطالعه ی ساختار و فعالیت چاپرونیαA -کریستالین های انسانی طبیعی و پراکسی نیتریته شده و بررسی نقش محافظتی آن ها در برابر اکسایش اسید آسکوربیک به وسیله ی یون های مس………………………………………………………………………………………104
4-2-1- بیان زیر واحد هایαA و αB-کریستالین انسانی در سلول های BL21………………………………………………………………………………………………………………………105
4-2-2-تخلیص پروتئین هایαA و αB-کریستالین انسانی…………………………………106
4-2-3- مطالعه ی فرآیند پراکسی نیتریته شدن پروتئینαA -کریستالین انسانی……………………………………………………………………………………………………………………….108
4-2-3-1- مطالعه ی الکتروفورز ژلی پروتئینαA -کریستالین تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………………………………………..108
4-2-3-2-سنجش مقدار کربونیل پروتئین های αA و αB-کریستالین تغییریافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………………………..109
4-2-3-3- مطالعه ی فلورسانس تریپتوفان و عارضی پروتئین αA-کریستالین تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………….110
4-2-3-4-مطالعه ی فلورسانس دی تیروزین پروتئین αA-کریستالین تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………………………..111
4-2-3-5-مطالعه ی اسپکتروسکوپی مرئی-فرابنفش پروتئین αA-کریستالین تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………….111
4-2-3-6- مطالعه ی تشکیل فیبر آمیلوئیدی پروتئین αA-کریستالین تغییر یافته……………………………………….…………………………………………….112
4-2-4- مطالعه ی اثر محافظتیαA -کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته بر اکسایش اسید آسکوربیک در حضور یون مس………………………………………………………..114
4-2-5-مطالعه ی فعالیت چاپرونی پروتئینαA -کریستالین طبیعی و تغییر یافته………………………………………………………………………………………………………………………….116
4-2-6- مطالعه ی فعالیت چاپرونی پروتئینαA -کریستالین طبیعی و تغییر یافته در حضور یون مس………………………………………………………………………………………………………..117
نتیجه ی نهایی………………………………………………………………………………………………….119
فهرست منابع و مآخذ……………………………………………………………………………………..121

فهرست جداول
عنوان و شماره صفحه
جدول3-1- مواد لازم جهت تعیین منحنی استاندارد محلول برادفورد…………………………………. 54
جدول3-2- مقادیر لازم از مواد مختلف مورد نیاز جهت تهیه 500 میلی لیتر بافرتانک………. 56
جدول3-3- مقادیر لازم از مواد مختلف مورد نیاز جهت تهیه 25 میلی لیتر بافرنمونه X2…………………………………………………………………………………………………………………………………………… 57
جدول 3-4- مقادیر لازم از مواد مورد نیاز جهت تهیه 1000 میلی لیتر محیط کشت جامد…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 64
جدول 3-5- مقادیر لازم از مواد مورد نیاز جهت تهیه 1000 میلی لیتر محیط کشت مایع………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 65
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل1-1- نمایی از ساختار لنز چشم و اهمیت پروتئین های کریستالین لنز در عملکرد آن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………6
شکل 1-2- نمایی از ساز و کار فعالیت چاپرونی………………………………………………………………………15
شکل 1-3- نمایی از ساختار لنز (A)، سیستم جریانی میکرو درونی (B) و نمای سیستم جریانی از مقطع عرضی ناحیه ی استوایی………………………………………………………………………………. 22
شکل 1-4- نمایی از مسیر فعال شدن کالپین به وسیله ی کلسیم در لنز……………………………. 27
شکل 1-5- نمایی از تولید پراکسی نیتریت به وسیله ی ماکروفاژ تحریک شده…………………….30
شکل 1-6- نمایی از بیوشیمی پراکسی نیتریت و اهداف آن…………………………………………………..33
شکل 1-7- نمایی از اثر فیزیولوژیک وپاتولوژیک پراکسی نیتریت بر مولکول های زیستی………………………………………………………………………………………………………………………………………..37
شکل 1-8- نقش سوپراکسید و پراکسی نیتریت در ساز و کار عملکرد بد قلب و عروق در دیابت………………………………………………………………………………………………………………………………………….40
شکل 3-1- منحنی استاندارد محلول برادفورد…………………………………………………………………………55
شکل3-2-نمایی از واکنش گروه کربونیل با 4،2- دی نیترو فنیل هیدرازین…………………………59
شکل 3-3-نمایی از طیف جذبی ترکیب فلور ANS ………………………………………………………………60
شکل 3-4- نمایی از طیف جذبی تیوفلاوین T- ……………………………………………………………………..61
شکل 3-5-ساختار اسید آسکوربیک…………………………………………………………………………………………62
شکل3-6-نمایی از طیف جذبی آلفا-کریستالین……………………………………………………………………. 63
شکل3-7-نمایی از طیف جذبی انسولین………………………………………………………………………………… 64
شکل 3-8- نمایی از دستگاه جمع آوری نمونه ((Fraction collector………………………………. 68
شکل 3-9- نمایی از دستگاه طراحی شده توسط Robinson و Beckman ………………………..70
شکل 3-10- نمایی از دستگاه سنتز پراکسی نیتریت در آزمایشگاه شیمی پروتئین (PCL)بر اساس طرح Robinson و Beckman ………………………………………………………………………………………71
شکل 3-11-نمایی از طیف جذبی پراکسی نیتریت و پراکسید هیدروژن (منحنی داخلی) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………..71
شکل 3-12- نمایی از دستگاه الکتروفورز ژلی ………………………………………………………………………..79
شکل 3-13- نمایی از مسیر اکسایش اسید آسکوربیک به وسیله ی یون مس………………………79 شکل 4-1-1- مسیر احتمالی برای نقش پراکسی نیتریت و کلسیم در ایجاد عارضه ی آب مروارید و نابینایی ……………………………………………………………………………………………………………………..84
شکل 4-1-2- نمایی از نمونه های TSPs پس از انکوبه …………………………………………………………86
شکل 4-1-3- مقایسه ی وضعیت الیگومری و ویژگی های ساختاری TSPs طبیعی و تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت …………………………………………………………………………………………..88
شکل 4-1-4- مطالعه ی هضم نمونه های TSPs طبیعی و تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت در حضور کیموتریپسین……………………………………………………………………………………………… 91
شکل 4-1-5- اثر کلسیم بر توده ای شدن TSPs طبیعی و تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت……………………………………………………………………………………………………………………………………… 92
شکل 4-1-6- مطالعه ی سینتیکی القاء توده ای شدن TSPs طبیعی و تغییر یافته به وسیله ی یون کلسیم……………………………………………………………………………………………………………………………93
شکل 4-1-7- تغییر الگوی حرکت الکتروفورزی نمونه های TSPs انکوبه شده با کلسیم به مدت 24 ساعت……………………………………………………………………………………………………………………….. 95
شکل 4-1-8- تغییر حرکت الکتروفورزی نمونه های TSPs انکوبه شده با کلسیم به مدت 2 هفته…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 97
شکل 4-1-9- مطالعه ی SDS-PAGE نمونه های TSPs انکوبه شده با کلسیم برای مدت 24 ساعت و 2 هفته قبل و بعد از سانتریفیوژ……………………………………………………………………………….. 98
شکل 4-1-10- مطالعه ی فلورسانس ANS نمونه های مختلف TSPs…………………………….. 100
شکل 4-1-11- مطالعه ی فلورسانس تیوفلاوین-T نمونه های مختلف TSPs…………………. 102
شکل 4-1-12- نقش احتمالی توأم پراکسی نیتریت و کلسیم در ایجاد عارضه ی آب مروارید…………………………………………………………………………………………………………………………………… 103
شکل 4-2-1- نمایی از باکتری اشیریشیا کلی سویه BL21(DE3)کشت داده شده در محیط کشت جامد (a) و مایع (b)…………………………………………………………………………………………………… 105
شکل 4-2-2- نمایی از ژل SDS-PAGE 12 درصد محلول های پروتئینی حاوی αA و αB-کریستالین القا شده به وسیله ی IPTG…………………………………………………………………………………106 شکل 4-2-3- نمایی از رسوب به دست آمده پس از سانتریفیوژ …………………………………………106 شکل 4-2-4- کروماتوگرام ستون تعویض آنیونی Q- سفاروز و فیلتراسیون ژلی سفاکریلS-300 پروتئین هایαA -کریستالین (a) و αB-کریستالین (b)………………………………………………107 شکل 4-2-5- نمایی از ژل SDS-PAGE 12 درصد نمونه های پروتئینیαA و αB-کریستالین……………………………………………………………………………………………………………………………… 108 شکل 4-2-6- مطالعه ی حرکت الکتروفورزی پروتئینαA –کریستالین و تعیین محتوی کربونیل αA و αB-کریستالین طبیعی و تغییر یافته…………………………………………………………. 110
شکل 4-2-7- مطالعه ی تغییر ویژگی های ساختاری αA-کریستالین طبیعی و تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت…………………………………………………………………………………………………….. 113
شکل 4-2-8- مطالعه ی اثر محافظتیαA -کریستالین طبیعی و تغییر یافته بر اکسایش اسید آسکوربیک القا شده به وسیله ی یون مس………………………………………………………………………….. 115
شکل 4-2-9- مطالعه فعالیت چاپرونی پروتئینαA -کریستالین طبیعی و تغییر یافته……………………………………………………………………………………………………………………………………… 117
شکل 4-2-10- مطالعه فعالیت چاپرونی پروتئینαA -کریستالین طبیعی و تغییر یافته در حضور یون مس…………………………………………………………………………………………………………………….. 118

جدول اختصارات رساله
نام اختصاری نام کامل
3-NT
BH4
iNOS
LDL
Mn-SOD
DHA
NFκB
PARP
ACD
PGIS
LPS
TNF
MAPK
IPTG
EDTA
DNPH
ANS
ThT

SDS
DTT
3-nitrotyrosine
Tetrahydrobiopterin
Inducible nitric oxide synthase
Low-density lipoprotein
Manganese superoxide dismutase
Dehydroascorbic acid
Nuclear factor-κB
Poly (ADP-ribose) polymerase
Alpha crystallin domain
Prostacyclin synthase
Lipopolysaccharide
Tumor necrosis factor
Mitogen-activated protein kinases
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Ethylenediaminetetraacetic acid
2,4-dinitrophenylhydrazine
1-anilino-8-napthalenesulfonic acid
Thioflavin T
Sodium dodecyl sulfate
Dithiothreitol

فصل اول
مقدمه
مقدمه
1-1- ساختار و نمو لنز چشم
لنز1 یک عضو کلیدی انکساری چشم است. لنز دارای شکل دوسوکوژ با خاصیت انکساری بالا و شفافیت کامل است که به کمک قرنیه تصاویر را بر روی شبکیه2 متمرکز می کند. ساختار شفاف لنز که در پشت عنبیه قرار دارد به وسیله ی زنول ها3 در زلالیه4 معلق شده است. زنول ها به جسم مژگانی5 که پیرامون لنز را احاطه کرده است متصل شده اند. ماهیچه های درون جسم مژگانی با تغییر کشش رباط ها، شکل لنز را تغییر می دهند. چشم با تغییر شکل لنز، می تواند بر روی اشیاء در فواصل گوناگون تمرکز کند که به این عمل تطابق6 گفته می شود (Michael و Bron 2011، Loh و همکاران 2009). در بزرگسالان، لنز با ضخامت 5/3 تا 4 میلیمتر و با قطر 9 تا ۱۰ میلیمتر دیده می شود Forrester) و همکاران 1996).
1-1-2- لنز جنینی
لنز چشم یک بافت بدون رگ پوشیده شده با کپسول کلاژنی محکم اما پر منفذ است که از یک لایه از سلول های اپیتلیال در سطح پیشین تشکیل شده است (Donaldson و همکاران 2010، Kuszak 1984). لنز تمام مواد غذایی و اکسیژن را از زلالیه به دست می آورد. در ناحیه ی استوایی لنز، سلول های اپیتلیال تمایز و طویل شدن را آغاز می کنند تا به سلول های فیبری تبدیل شوند. در طول این زمان سلول های اپیتلیال اندامک خود را از دست می دهند و سنتز مقدار زیادی از پروتئین های ساختاری کریستالین را آغاز می کنند (شکل 1-1). این فرآیند در طول زندگی با سرعت آهسته تری همراه با راندن سلول های فیبری جدیدتر یا جوان تر به ناحیه ی مرکزی (هسته) ادامه پیدا می کند (Jaffe و Horwitz 1991، Lovicu و Robinson 2004). تکامل لنز با فرورفتگی پلاک لنز7 به طرف فنجان بینایی8 و تبدیل شدن به حفره ی لنز آغاز می شود. ضمن ادامه ی این فرورفتگی، حفره بسته می شود و وزیکول لنز9 در انسان طی روز سی و سوم جنینی تشکیل می شود. پس از آن، تمایز سلول های اپیتلیال، پر شدن وزیکول را آغاز می کند تا همه ی حفره در انتهای هفته ی هفتم با سلول های فیبری گرفته شود. سلول های فیبری اولیه که مرکز لنز را اشغال کرده اند هسته جنینی را تشکیل می دهند (Lovicu و Robinson 2004، Kuszak 1984). تکامل لنز بدون از دست دادن همه ی اندامک های متفرق کننده ی نور از سلول های فیبری کامل نمی شود. این عمل در یک فرآیند برنامه ریزی شده به وسیله ی پروتئاز ها انجام می شود (Bassnett 2009، Bassnett 2002). لنز بیضی شکل جنینی در آغاز دارای قطر 35/0 میلی متر است که به سرعت رشد خود را آغاز می کند تا به یک اندام بیضی شکل حدود 35 میلی گرم در هنگام تولد تبدیل شود. مطالعات بر روی لنز های انسان در سنین بین شش ماه تا نود و نه سال نشان می دهد که لنز در دو فاز شامل فاز مجانبی (Asymptotic) در طول دوره ی پیش از تولد و ابتدای کودکی و فاز خطی در باقی مانده ی زندگی شخص رشد می کند (Jaffe و Horwitz 1991، Augusteyn 2007). چون لنز از فیبرهایی که نشان دهنده ی سنین مختلف است تشکیل شده، بافت جذابی برای مطالعه ی اثرات پیری بر عملکرد و ساختار پروتئین است ( Sharmaو Santhoshkumar 2009)
1-1-3- کپسول و اپیتلیوم لنز
کپسول لنز10 یک غشای پایه الاستیک با ساختار لایه ای است که در قسمت جلو از سلول های اپیتلیال و در قسمت عقب از سلول های فیبری تشکیل شده است. ترکیبات کلاژن نوع IV11، لامینین12، انتاکتین13، هپارین سولفات پروتئوگلیکان14 و فیبرونکتین15 از از اجزای اصلی کپسول لنز هستند و به قالب بندی شکل لنز کمک می کنند (Jaffe و Horwitz 1991). کپسول لنز در هنگام تولد 4 میلی متر ضخامت دارد و در طول زندگی رشد می کند اما با افزایش سن ضخامت آن به 30 میلی متر در ناحیه ی سطحی کپسول پیشین می رسد. ویژگی های مکانیکی کپسول لنز با افزایش سن کاهش می یابد که می تواند به تغییرات رخ داده در کلاژن کپسول نسبت داده شود (Danysh و Duncan 2009). یک لایه از سلول های اپیتلیالی مکعبی قسمت جلویی لنز را می پوشاند که می تواند به دو ناحیه شامل اپیتلیوم مرکزی تقسیم نشده و اپیتلیوم تقسیم شده (زایشی) که در ناحیه ی قوسی تمایز می یابد تقسیم می شود. در طول عمر فرد سلول های اپیتلیال لنز ویژگی های مشخصی از تقسیم و تمایز به سلول های فیبری جدید دارند اما این فرآیند با افزایش سن کاهش می یابد. اپیتلیوم لنز16 قسمت بزرگی از انتقال، سوخت و ساز و سم زدایی است، چون سلول های فیبری لنز حجمی از مواد مغذی را از طریق سلول های اپیتلیال می گیرند ( Sharmaو Santhoshkumar 2009، Balaram 2000). سلول های اپیتلیال اولین خط دفاعی علیه ترکیبات اکسایشی فراهم می آورند (Andley 2008).
1-1-4- سلول های فیبری لنز چشم
سلول های فیبری لنز17 که طویل، باریک و شفاف هستند به صورت منظم در کنار یکدیگر قرار گرفته اند ( Forresterو همکاران 1996). سلول های فیبری دارای مقطع عرضی شش وجهی مسطحی هستند که بسته بندی آن ها را در یک آرایش منظم با فضاهای بین سلولی کمتر از طول موج نور تسهیل می کند Donaldson) و همکاران 2010). هر سلول فیبری از قطب پیشین به پسین، جایی که یک شکاف18 با بقیه ی سلول های فیبری تشکیل می دهد، کشیده می شود Kuszak) و همکاران 1984). این سلول ها از تقسیم و کشیده شدن سلول های اپیتلیال در ناحیه ی زایشی ایجاد می شوند و در نهایت به سلول های فیبری که اکثر حجم لنز را تشکیل می دهند تمایز می یابند. در طول تمایز سلول های اپیتلیال لنز به سلول های فیبری، همه ی اندامک های سلول تجزیه شده که این پدیده به سلول های بدون هسته، میتوکندری، جسم گلژی و شبکه ی آندوپلاسمی منجر می شود (Horwitz 1993). این عمل لازمه ی شفافیت و عملکرد صحیح لنز است که نقص آن باعث آب مروارید می شود. چون لنز چشم به طور پیوسته در طول زندگی رشد می کند، قطعات بریده شده از لنز مانند حلقه های سالیانه ی درخت هستند به طوری که سلول های فیبری سطحی جوانترین سلول ها هستند (Graw 2008). فیبر های سطحی تر از لحاظ متابولیکی فعال و سلول های هسته دار هستند در صورتی که فیبر های عمقی تر، بیشتر لنز بزرگسالان را تشکیل می دهند و بدون اندامک هستند (Winkler و Riley 1991). در انسان در هنگام تولد تقریباً 6/1 میلیون، در سن 20 سالگی حدود 3 میلیون و در سن 80 سالگی تقریباً 5/3 میلیون سلول های فیبری وجود دارد. یکی از نتایج الگوی رشد منحصر به فرد لنز در سلول های فیبری تمایز یافته، نبود تجزیه و ساخت مجدد19 پروتئین است. بنابراین مرکز لنز انسان 70 ساله شامل پروتئین هایی است که در طول دوره ی جنینی ساخته شده اند (Horwitz 2003).
1-1-5- مصرف انرژی و همئوستاز یونی لنز چشم
انرژی موردنیاز برای رشد و شفافیت لنز عمدتاً از گلوکز به دست می آید. حدود 70 درصد از انرژی کل لنز از گلیکولیز بی هوازی20 به دست می آید. آب و محیط یونی لنز به وسیله ی پمپ های یونی مانند پمپ Na+/K+ATPase و Ca2+ ATPase که در اپیتلیوم نزدیک استوا تجمع یافته اند حفظ می شود. کانال های یونی در این عملکرد تنظیمی نیز مشارکت می کنند. تعادل یونی به وسیله ی اتصالات منفذدار21 که در قسمت کوچکی از غشا لنز انسان وجود دارد تسهیل می شود. MIP2622 یاAQP0 23، 60 درصد پروتئین های غشای لنز را تشکیل می دهند که باعث انتقال آب بین سلول ها می شوند. پروتئین های اتصالات منفذدار، کانکسین 2443Cx43) ) در اپیتلیوم، کانکسین 46 و 50Cx46) و Cx50) در فیبر ها در حرکت مواد مغذی و سایر مولکول های کوچک بین سلول ها شرکت می کنند (Winkler و Riley 1991، Mathias و همکاران 2010، Michael و Bron 2011).
1-1-6- شفافیت لنز چشم
توانایی لنز چشمی در تمرکز نور بر روی شبکیه در نتیجه ی ویژگی های فیزیولوژیکی منحصر به فرد و ساختار بافتی خاص آن است که باعث شفافیت شده و پراکندگی نور را از بین می برد و ویژگی های بینایی لنز را نیز افزایش می دهد ( Donaldsonو همکاران 2001). شفافیت لنز به نبود رگ خونی، کم بودن اندامک ها، فواصل بین فیبری باریک و سازمان دهی منظم سلول ها و پروتئین های آن بستگی دارد (Bassnett و همکاران 2011). فقدان رگ خونی و در سطح سلولی، نبود اندامک هایی مانند هسته، میتوکندری و شبکه آندوپلاسمی باعث کاهش پراکندگی نور می شوند (Bloemendal و همکاران 2004). کریستالین ها پروتئین های عمده ی لنز چشم هستند که تمایل به تشکیل توده های محلول دارند و در بسته بندی فشرده و متراکم در سلول های فیبری قرار دارند. بنابراین این پدیده ضریب شکست25 لنز را افزایش و شفافیت آن را حفظ می کند. بسته بندی متراکم سلول های فیبری فضاهای بین سلولی را به اندازه ای کمتر از طول موج نور کاهش می دهد (Zhang و Jacob 1997). علاوه بر این غلظت بالا و نظم خاص کریستالین های موجود در لنز به شفافیت آن کمک می کند (Andley و همکاران 2007).

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

شکل1-1- نمایی از ساختار لنز چشم و اهمیت پروتئین های کریستالین لنز در عملکرد آن.
1-2- پروتئین های لنز چشم
لنز از غلظت بسیار بالای پروتئین ها (تقریباً 300 میلی گرم در میلی لیتر) تشکیل شده که برای ویژگی های انکساری بافت لازم است (Takemoto و Sorensen 2008). کریستالین های لنز، آلفا، بتا و گاما، بیش از 90 درصد کل پروتئین های محلولِ لنز چشم را تشکیل می دهند. سایر پروتئین ها شامل انواع اسکلت سلولی و غشایی مانند اکتین، اسپکترین، پروتئین های انتقال دهنده و کانالی، پروتئین های اتصالی و بسیاری از آنزیم های مربوط به سوخت و ساز، سنتز و تجزیه ی پروتئین ها هستند. سه نوع کریستالین لنز انسان از پروتئین های تقریباً 20 کیلو دالتون تشکیل شده اند که به صورت هتروالیگومرهای محلول در آب حدود 800 کیلودالتون(آلفا-کریستالین)، به صورت هتروالیگومرهای در حدود 50 تا 250 کیلودالتون (بتا کریستالین) و در مورد گاما کریستالین به صورت مونومر وجود دارند. غلظت بالای این پروتئین ها در فیبرهای لنز برهمکنش بین انواع کریستالین ها شامل آلفا/بتا، آلفا/بتا/گاما، بتا/گاما و گاما/گاما و بین پروتئین های کریستالینی و غیرکریستالینی مانند اکتین و لیپیدهای غشای فیبر افزایش می دهد (Michael و Bron 2011). هموژنیزه کردن لنز انسان در آب یا بافر و سانتریفیوژ آن دو بخش مختلف شامل بخش محلول در آب26 (WS) و بخش نامحلول در آب27 (WIS) را ایجاد می کند ( Sharmaو Santhoshkumar 2009، Jaffe و Horwitz 1991). نزدیک به 50 درصدِ پروتئین های لنز انسان در پیری (بالای 50 سال) وارد بخش نامحلول می شود و به این ترتیب میزان پروتئین های نامحلول با بالا رفتن سن افزایش می یابد (Roy و Spector 1976، Sharmaو Santhoshkumar 2009، Jaffeو Horwitz 1991). در مقایسه با قسمت محلول، بخش نامحلول شامل تقریباً قسمت بزرگی از کریستالین های با اتصالات متقاطع و تغییریافته است (Jaffe و Horwitz 1991). کریستالین ها در قسمت نامحلول، توده های اولیه ی متفرق کننده ی نور در لنزهای پیر هستند. مطالعات نشان می دهد که در لنز انسان، ناحیه هسته ای، پیرترین قسمت لنز، دارای بیشترین درصد پروتئین های نامحلول است و این پروتئین ها بالاترین درجه از تغییرات و ویژگی های پراکنش نور را نشان می دهند ( Jaffeو Horwitz 1991، Benedek 1997، Harrington و همکاران 2007، Jedziniak 1973و همکاران، Benedek و همکاران1987، Ortwerth و Olesen 1992، Ortwerth و همکاران 1992، Lund و همکاران 1996، Hanson و همکاران 2000، Wilmarth و همکاران 2006، Hains و Truscott 2007).
1-2-1- آلفا-کریستالین
پروتئین آلفا-کریستالین بیش از 50 درصد کل پروتئین های محلول لنز چشم پستانداران را تشکیل می دهد (de Jong 1981). آلفا-کریستالین دارای دو زیرواحد آلفاA (αA) و آلفاB (αB) با وزن مولکولی تقریبی 20 کیلو دالتون است که با نسبت مولی 3 به 1 در لنز حضور دارد و این نسبت با افزایش سن تغییر می کند. این پروتئین به صورت کمپلکس هترو الیگومر با وزن مولکولی حدود 800 کیلو دالتون می باشد که شامل 15 تا 50 زیر واحد پروتئین است ( Sharmaو Santhoshkumar 2009،Horwitz 2003، Groenen و همکاران 1994). آلفا-کریستالین بیشتر در سلول های لنز چشم بیان می شود اما زیر واحد αB در بافت های دیگری غیر از لنز مانند قلب، ماهیچه ی اسکلتی، پوست، مغز، طناب نخاعی و ریه نیز حضور دارد. افزایش سطح -αBکریستالین با بیماری های عصبی مانند بیماری الکساندر، جنون گاوی، آلزایمر و پارکینسون ارتباط دارد (Iwaki و همکاران 1989، Iwaki و همکاران 1992، Renkawek و همکاران 1992، Lowe و همکاران 1992، Bhat و Nagineni 1989، Dubin و همکاران 1989، Iwaki و همکاران 1990، Horwitz 1993). بیان αA -کریستالین اساساً محدود به لنز است، ولی در موارد محدود در برخی از بافت‌های دیگر نیز یافت شده است (Srinivasan و همکاران 1992). پروتئین αA و -αBکریستالین به وسیله ی دو ژن Cryaa و Cryab کد می شود. در انسان ژن Cryaa بر روی کروموزوم 21 و ژن Cryab بر روی کروموزوم 11 قرار دارد. این دو پروتئین با 57 درصد شباهت به ترتیب دارای 173و 175 اسیدآمینه می باشند (Graw 2008، Horwitz 2003). مطالعات ساختار دوم آلفا-کریستالین با دستگاه دو رنگ نمایی دورانی (CD) مشخص کرده است که این پروتئین عمدتاً از صفحات چین دار بتا تشکیل شده است و واجد تنها مقادیر ناچیزی از مارپیچ آلفا است ( Thomson و Augusteyn1989).
آلفا-کریستالین متعلق به خانواده ی پروتئین های کوچک شوک گرمایی28 (sHsps) است و از چهار ناحیه ی ساختاری تشکیل شده است. این پروتئین دارای یک دُمین مرکزی حفاظت شده به نام دُمین آلفا-کریستالینی29 (ACD) با حدود 90 اسیدآمینه است که این دُمین در تمام پروتئین های خانواده ی شوک گرمایی مشترک است (de Jong و همکاران 1998،Augusteyn 2007). دُمین آلفا-کریستالینی از صفحات بتای شبه ایمنوگلوبولینی تشکیل می شود که برای فعالیت چاپرونی30 آن مهم است. این دُمین در مجاورت دُمین انتهای N31 و ناحیه ی گسترش یافته ی انتهای C32 که شامل یک موتیف کوچک حفاظت شده یIXI/V است قرار دارد. دُمین انتهای N در برهمکنش زیرواحدها، آرایش پروتئین ها و فعالیت چاپرونی نقش دارد و ناحیه ی گسترش یافته ی انتهای C که یک ناحیه ی بسیار قطبی و انعطاف پذیر دارای 10 تا 12 آمینواسید است در حلالیت پروتئین موثر است. بخش دیگر آلفا-کریستالین ناحیه ی گسترش یافته ی بسیار متنوع و آبگریز انتهای N است که به برهمکنش چاپرون با پروتئین هدف کمک می کند. ساختار الیگومری آلفا-کریستالین بسیار پویا و قادر به تبادل زیرواحدها، بین حالات دایمری و الیگومری است و این ویژگی در فعالیت چاپرونی آن نقش مهمی دارد (Bloemendal و همکاران 2004، Delbecq و Klevit 2013، Wieligmann و همکاران 1998، Carver و همکاران 1998، van den Oetelaars و همکاران 1990).
آلفا-کریستالین علاوه بر نقش ساختاری در لنز، به عنوان یک چاپرون نیز عمل می کند. آلفا-کریستالین با فعالیت چاپرونی نقش مهمی در شفافیت لنز ایفا می کند و از توده ای شدن33 و رسوب پروتئین های دیگر از جمله بتا و گاما کریستالین در لنز چشم جلوگیری می کند. فعالیت چاپرونی آلفا-کریستالین می تواند توده ای شدن پروتئین های آسیب دیده به وسیله ی اکسایش، گرما یا سایر استرس ها را سرکوب کند (Bloemendal و همکاران 2004 ، Kumar و همکاران 2007، Horwitz 2003، Horwitz 1992، Harding 2002). تمام کریستالین ها، بسیاری از آنزیم ها مانند گلیسرآلدهید3- فسفات دهیدروژناز34، انولاز35، انواع عناصر اسکلت سلولی در سلول وغشای پلاسمایی لنز و پروتئین های وابسته به آن از جمله پروتئین های هدف آلفا-کریستالین هستند (Valasco و همکاران 1997، Boyle و Takemoto 1996، Cobb و Petrash 2002، Horwitz 2003). بنابراین فعالیت چاپرونی آلفا-کریستالین به خصوص در لنزهای پیر نقش مهمی در جلوگیری از تجمع پروتئین های نامحلول که باعث پراکندگی نور و از دست دادن شفافیت و در نهایت آب مروارید می شود دارد. آلفا-کریستالین علاوه بر حفاظت لنز در مقابل انواع استرس، در بازآرایی و حفاظت اسکلت سلولی و مهار مرگ برنامه ریزی شده ی سلول نقش دارد. αB-کریستالین به طور ویژه با اکتین و دسمین در قلب متصل می شود و از توده ای شدن اکتین جلوگیری می کند. αA-کریستالین با اتصال به Bax و Bcl-S از مرگ برنامه ریزی شده ی سلول جلوگیری می کند (Andley 2007، Wawrousek و همکاران 1990، Voorter و همکاران 1986، Graw 2008).
1-2-2- بتا-گاما کریستالین
بتا و گاما کریستالین ها دارای ویژگی مشترک در توالی پروتئینی خود هستند. به همین دلیل این پروتئین ها به اَبَرخانواده ی بتا-گاما کریستالین تعلق دارند. بتا کریستالین الیگومری و گاما کریستالین مونومری دارای موتیف کلید یونانی با دو صفحه ی بتای موازی ناهمسو هستند. در تمام اعضای اَبَرخانواده ی بتا-گاما کریستالین، این موتیف چهار بار تکرار می شود که در دو دُمین سازمان یابی می شوند. تفاوت اصلی توالی این دو پروتئین در داشتن ناحیه ی گسترش یافته ی انتهای N و C در بتاکریستالین ها در مقایسه با گاما کریستالین ها است. برای عملکرد موتیف کلید یونانی36 مطالعات کامپیوتری نشان داده اند که این موتیف ها در اتصال بین دُمینی شامل اتصال درون مولکولی در گاما کریستالین ها و بین مولکولی در بتا کریستالین ها شرکت می کنند. از دیگر جنبه های عملکردی این موتیف ویژگی های اتصال به یون کلسیم است (Graw 2008، Bloemendal و همکاران 2004).
1-2-3- بتا کریستالین
بتا کریستالین ها به صورت الیگومرهایی با وزن مولکولی طبیعی 200 کیلودالتون و به شکل اکتامری شناخته شده اند. بتا کریستالین دارای چهار زیرواحد اسیدی (A1-A4) و سه زیرواحد بازی (B1-B3) است که وزن مولکولی هر یک بین 22 تا 28 کیلودالتون است. هر زیرگروه به وسیله ی سه ژن کد می شود. بخش گسترش یافته ی انتها ی N نقش مهمی در دایمر37 و اولیگومرشدن38 بتا کریستالین ایفا می کند. از میان بتا کریستالین ها، کریستالین بتا B2، مهم ترین بتا کریستالین لنز است (Graw 2008،Bloemendal و همکاران 2004).
1-2-4- گاما کریستالین
گاما کریستالین ها در کروماتوگرافی ژلی پروتئین های لنز در آخرین قله ظاهر می شوند که این به علت وزن مولکولی و ساختار مونومری آن ها است. گاما کریستالین دارای هفت نوع مختلف از زیرواحد های حدود 20 کیلودالتون است که زیرواحدهای A تا F آن به صورت یک خوشه ی ژنی39 بیان می شوند (Graw 2008،Bloemendal و همکاران 2004). گاما کریستالین S، تنها گاما کریستالینی که در همه‌ی گونه‌های مهره‌داران وجود دارد و در بافت‌های متعدد خارج ِلنزی نیز مشاهده شده است (van Rens و همکاران 1989). در انسان گاما کریستالین های E و F بیان نمی شوند اگرچه این دو زیرواحد در لنز چشم گاو تشخیص داده شده اند (Sharma و Santhoshkumar 2009،Bloemendal و همکاران 2004). گاما کریستالین ها دارای مقدار زیادی اسیدآمینه ی سیستئین آزاد (4 تا 7 اسیدآمینه در هر مولکول) هستند که آن ها را به تشکیل پیوند های دی سولفید در طول استرس اکسایشی حساس می کند (Graw 2008).
1-3- برهمکنش کریستالین ها و تداخل بین آن ها
کریستالین ها اصلی ترین پروتئین های لنز چشم هستند که در یک ساختار فشرده و منظم بصورت آرایه ای از پروتئین ها کنار هم قرار گرفته اند. این نظم و فشردگی باعث می شود که لنز چشم شفاف باشد. این فشردگی و نظم در اثر برهمکنش میان پروتئین های لنز ایجاد می شود. برهمکنش های پروتئین های لنز چشم شامل برهمکنش‌های میان مولکولی40 و برهمکنش های فرامولکولی41 است. برهمکنش های میان مولکولی، برهمکنشِ پروتئین های همسان با همدیگر و برهمکنش های فرامولکولی، برهمکنشِ بین کریستالین های مختلف است. بین همه زنجیره های پپتیدی کریستالین ها، برهمکنش های میان مولکولی و فرامولکولی وجود دارد. برای مثال زنجیره های αA با هم همودایمرهای αA-αA تشکیل می دهند (بر همکنش میان مولکولی) و یا یک زنجیره αA با یک زنجیره αB بصورت هترودایمر (بر همکنش فرامولکولی) برهمکنش دارند. در آلفا-کریستالین ها، این همودایمرها و هترودایمرها باهم به صورت هتروالیگومرهای بزرگی در می آیند. این برهمکنش ها میان زنجیره های بتا کریستالین هم وجود دارد با این تفاوت که هتروالیگومرهای بتا کریستالین کوچکتر از هتروالیگومرهای آلفا-کریستالین هستند. گاما کریستالین ها اغلب به صورت مونومر هستند. میان زنجیره های آلفا-کریستالین، بتاکریستالین و گاماکریستالین نیز برهمکنش های فرامولکولی برقرار است که قوی ترین برهمکنش ها میان زنجیره های آلفا با گاما کریستالین است ( Bloemendal1977).
برهمکنش های میان کریستالین ها بسیار دقیق است. برهمکنش درست و صحیح این پروتئین ها برای جلوگیری از توده ای شدن پروتئین ها لازم است. به همین دلیل هرگونه تداخل در این برهمکنش ها باعث می شود که ساختار منظم و فشرده لنز به هم خورده و لنز شفافیت خود را از دست بدهد. با افزایش سن برهمکنش کوتاه و ضعیف بین آلفا و گاما کریستالین کم می شود که این امر ممکن است به افزایش توده ای شدن پروتیئن ها و از بین رفتن شفافیت لنز منجر شود. تغییرات شیمیایی پس از ترجمه از عوامل دیگری است که بر روی این برهمکنش ها تأثیر دارد. این تغییرات به دلیل نیمه عمر طولانی آلفا-کریستالین با افزایش سن در لنز تجمع می یابد و موجب تغییرات ساختاری و از بین رفتن برهمکنش های منظم و فشرده ی بین آن ها و نامحلول شدن پروتئین ها و در نهایت کدورت لنز و ایجاد آب مروارید می شود (Sharma و Santhoshkumar 2009، Liu و همکاران 2007، Bloemendal1977 ).
1-4- آب مروارید
به هر گونه کدورت لنز که شفافیت طبیعی آن را از بین می برد و موجب پراکندگی نور می شود آب مروارید42 می گویند که شایع ترین دلیل نابینایی در انسان و عامل 8/47 درصد نابینایی در دنیا است (Tabin 2008). در حال حاضر تنها راه درمان آب مروارید جراحی است (Fedorowicz و همکاران 2005).
مهم ترین عامل در تشکیل آب مروارید افزایش سن است (West و همکاران 1995). بر اساس مطالعات، آب مروارید وابسته به سن عامل بیش از 40 درصد نابینایی در جهان است که اکثر افراد دارای نابینایی ناشی از آب مروارید از کشورهای در حال توسعه هستند (Riaz 2006). مهم ترین عواملی که به بروز آب مروارید کمک می کنند شامل نورآفتاب، دیابت، داروهایی مانند کورتیکواستروئیدها، نیکوتین و مصرف زیاد الکل است (Harding 2002). احتمال تشکیل آب مروارید در افراد دیابتی پنج برابر بیشتر است. تجمع سوربیتول (به علت افزایش سطح قند در چشم به وسیله ی عمکرد آنزیم آلدوزردوکتاز43) باعث آسیب لنز می شود که منجر به برهم زدن تعادل اسمزی و تغییر نفوذپذیری غشا و در نهایت کدورت لنز می شود (Ederer و همکاران 1981، Kinoshita و همکاران 1979).
1-4-1- انواع آب مروارید وابسته به سن
آب مروارید وابسته به سن44 شایع ترین شکل آب مروارید در گروه سنی 45 سال و بیشتر است (Donnelly 1997). سه نوع آب مروارید وابسته به سن وجود دارد : 1- آب مروارید هسته ای45 2- آب مروارید پوسته ای46 3- آب مرواریدی که در ناحیه ی پشتی زیر کپسول (PSC)47 ایجاد می شود. ایجاد آب مروارید وابسته به سن دارای سازوکار خاصی شامل آسیب اکسایشی، توده ای شدن پروتئین ها، کاهش سطح گلوتاتیون لنز و آسیب غشای سلول های فیبری است.
1-4-1-1- آب مروارید هسته ای
آب مروارید هسته ای که در مرکز لنز اتفاق می افتد، افزایش آسیب اکسایشی پروتئین ها و لیپید های لنز را نشان می دهد (Spector و همکاران 1995) که باعث برهمکنش های پروتئین- پروتئین و در نهایت توده ای شدن و افزایش پراکندگی نور می شود. براساس شواهد، رابطه ای قوی میان افزایش سن و افزایش مقدار گلوتاتیون اکسایش یافته در هسته ی لنز وجود دارد که نشان دهنده ی برهم خوردن تعادل بین اکسایش پروتئین، لیپید و احیای وابسته به گلوتاتیون است (Bova و همکاران 2001، Sweeney و همکاران 1998).
1-4-1-2- آب مروارید پوسته ای

دسته بندی : پایان نامه ارشد

پاسخ دهید